培養溫度的要求總大腸菌群中的細菌除生活在腸道中外
，在自然環境中的水與土壤中也經常存在，但此等在自然環境中生活的大腸菌群培養的合適溫度為25℃左右，
如在37℃培養則仍可生長，但如將培養溫度再升高至44.5℃，則不再生長，而直接來自糞便的大腸菌群細菌，習慣于37℃左右生長，如將培養溫度升高至44.5℃仍可繼續生長。
因此，可用提高培養溫度的方法將自然環境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區分，兩種方法也都基于此理。
將接種好的樣品或裝有濾膜的培養基放入生化培養箱時，箱內溫度一定要達到所要求的溫度(44.5±0.5℃)時，方可放入。如用恒溫水浴箱時，其水面要高于接種物面，放濾膜的培養皿要沉到水浴箱底部。
2.加氯水樣的處理經氯處理消毒過的水樣
，水中含有一定量的余氯，使大腸菌群處于受損或受抑制狀態，在采集水樣時應提前在采樣瓶中加硫代硫酸鈉，硫代硫酸鈉可以脫氯，
使受損的細菌得以復蘇與修復，從而避免出現計數結果偏低甚至假陰性的現象。此外余氯對濾膜法培養的細菌其抑制作用尤為明顯，所以抽濾時應對水樣進行大量無菌水稀釋，以減少余氯的殘留。
3.樣品的保存采樣用的容器使用前應蓋好瓶蓋
，用牛皮紙將瓶蓋和瓶頸處包裹好，置干燥箱160℃-170℃干熱滅菌2h，或用高壓蒸汽滅菌器121℃滅菌15min。
采樣后水樣的正確保存也很重要，如保存不當可使樣品中的大腸菌群細菌死亡或在一定條件下再生長，這些都將影響檢測結果的準確性。
檢測室接到水樣后，應立即檢測，如因故不能檢測時，應立即將樣品置于冰箱內(2℃-10℃)并于2小時內檢測。